Obiettivi Formativi

Fornire allo studente i principi teorico-pratici delle principali metodiche per l’identificazione, l’isolamento, e lo studio strutturale e funzionale delle macromolecole biologiche, nonché strumenti intellettuali per l'analisi dei risultati e per la loro descrizione.

Learning Goals

To provide students the theoretical and practical principles of the main methodologies for the identification, isolation and structural and functional study of biological macromolecules, as well as intellectual tools for the analysis of results and their interpretation.

Metodi didattici

L’insegnamento nella sua totalità prevede lezioni frontali in aula e attività di laboratorio volte all’approfondimento pratico delle nozioni impartite. Il corso si avvale della combinazione di 54 ore: (5CFU) di lezioni frontali e di 24 ore (2 CFU) di laboratorio. Le lezioni frontali si svolgeranno con ausilio di lavagna e video proiettore. Gli Studenti possono porre domande in qualsiasi momento. Le attività di laboratorio saranno svolte in appositi locali adibiti allo scopo dove gli studenti familiarizzeranno con le comuni attrezzature e tecniche di un laboratorio biochimico.

Teaching Methods

The teaching is organized in oral lection and laboratori activities. It will be performed in 54 hours: -30 hours of oral lessons -24 hours of laboratory activity The lecture is given orally, with the assistance of blackboard and overhead projector. Students may submit questions at any time. Laboratory activities will be performed in suitable space set up with the aim to introduce student to acquire the basic notion and laboratorial experimental expertise in biochemistry.

Prerequisiti

Sono necessarie solide basi di Fisica, Chimica e Biochimica e conoscenze inerenti alla struttura base delle proteine e degli enzimi

Prerequisites

Basic knowledge of Physics, Chemistry, and Biochemistry, as well as knowledge on protein and enzyme structure.

Verifiche dell'apprendimento

Esame orale che prevede la formulazione di almeno tre domande. Lo studente deve rispondere esaurientemente a tutte le domande formulate. Il voto è funzione della maturità e competenza dimostrata dallo studente nell’esposizione delle risposte fornite alle domande formulate.

Assessment

Oral examination with the formulation of at least 3 questions. The student must answer all the questions in an exhaustive manner. The vote is a function of the maturity and quality showed by the student during the answers exposition to the formulated questions.

Programma del Corso

Elementi di base per la sicurezza e lo svolgimento dell’attività di laboratorio in biochimica. Studi in vivo e in vitro. pH e tamponi. Scelta di un tampone per la sperimentazione biologica. Isolamento e purificazione di componenti subcellulari. Scelta del sistema biologico. Ingegnerizzazione delle proteine per la purificazione. Isolamento dell'organo. Frazionamento cellulare (metodi di rottura di cellule e tessuti). Centrifugazione e separazione per centrifugazione. Principi base della sedimentazione. Centrifughe e loro uso. Rotori. Metodi di separazione nella centrifugazione preparativa. Centrifugazione differenziale. Centrifugazione in gradiente di densità. Scelta, efficacia ed applicazione dei vari rotori. Problemi di sicurezza connessi all'uso delle centrifughe. Dialisi. Tecniche spettroscopiche per l’identificazione e la quantificazione determinazione delle macromolecole biologiche e dei campioni biologici (spettroscopia UV-Visibile, fluorescenza, RAMAN, dicroismo circolare, spettroscopia infrarossa). Metodi cromatografici per la determinazione delle macromolecole biologiche e dei campioni biologici (in particolare cromatografia per assorbimento, di ripartizione, a scambio ionico, per esclusione molecolare, per affinità ed interazione idrofobica) . Tecniche elettroforetiche Classificazione dei metodi elettroforetici. Elettroforesi in fase libera e zonale. Apparecchiatura per elettroforesi zonale Elettroforesi su gel. Elettroforesi su gel: PAGE, SDS-PAGE, Agarose. Western blotting : applicazioni biochimiche e diagnostiche. Elettroforesi bidimensionale. Elettroforesi capillare. Isoelettrofocalizzazione: principi , apparecchiatura e metodi. Immunochimica, principi e tecniche (immunoprecipitazione e immunodiffusione, immunoelettroforesi, E.L.I.S.A.). Determinazione quali-quantitativa delle proteine( metodi spettroscopici diretti o indiretti come i metodi di Lowry, Bradford, Biureto, Kyeldahl). Metodi per la determinazione dell’attività enzimatica. Studi sulla struttura delle proteine. Determinazione della composizione aminoacidica delle proteine: Idrolisi acida, alcalina, enzimatica. Fondamenti di proteomica e metabolomica Esempi di progettazione ed esecuzione pratica di esperimenti basandosi sulle principali tecniche di separazione, identificazione, e caratterizzazione delle macromolecole.

Course Syllabus

Basic notion of security in the biochemistry laboratory and of basic operative operations. Study in vivo and in vitro. Solutions, pH and buffer practical aspects. Isolation and purification of cellular elements. Selection of the appropriate source. Techniques of protein extraction and purification. Protein engineering to optimize recombinant protein purification. Overview of Cell Homogenization Techniques. Techniques of cellular fractionation. Centrifugation and related separation techniques. Basic principles. Different type of centrifuges and their appropriate utilization. Preparative centrifugation for the separation and identification of biological macromolecules and biological samples. Differential centrifugation. Centrifugation in density gradient of biological macromolecules and biological samples. Dialysis. Spectroscopic techniques for the identification and quantification of biological macromolecules and biological samples (UV-Visible spectroscopy, fluorescence, RAMAN, circular dichroism, infrared spectroscopy). Chromatographic techniques for the identification and quantification of biological macromolecules and biological samples (such as adsorption chromatography, hydrophobic chromatography, Ion-exchange chromatography, Exclusion chromatography or gel filtration, affinity chromatography). Electrophoretic techniques: general principles, factors that influence the electrophoretic mobility. Electrophoresis free phase. Zone electrophoresis on cellulose acetate, serum proteins. Gel Electrophoresis: PAGE, SDS-PAGE, Agarose. Methods of detection and quantitative assessments. Blotting - Western blotting in the study of proteins: biochemical and diagnostic applications. Isoelectric focusing (IEF). Two-dimensional electrophoresis. Capillary electrophoresis. Immunochemical principles and techniques (Immunoprecipitation and immunodiffusion, E.L.I.S.A.). Qualitative and quantitative determination of proteins (direct and indirect spectroscopic methods such as: Lowry, Bradford, Biureto and Kyeldahl assays). Enzymatic activity determination. Techniques for protein structure determination. Determination of aminoacid composition of proteins. Overview of proteomic and metabolomic technologies. Practical example of design and execution of biochemistry experiments based on the main biochemical methods used in the separation, identification, characterization and analysis of macromolecules.