Obiettivi Formativi

Obiettivo formativo: Fornire allo studente i principi teorico-pratici delle principali metodiche per lo studio e la caratterizzazione delle biomolecole. Verranno trattate le metodologie per l’identificazione, l’isolamento, e lo studio strutturale e funzionale delle macromolecole biologiche, nonché strumenti intellettuali per l'analisi dei risultati e per la loro descrizione.

Metodi didattici

L’insegnamento nella sua totalità prevede lezioni frontali in aula e attività di laboratorio volte all’approfondimento pratico delle nozioni impartite. Il corso si avvale della combinazione di 60ore : (5CFU) di lezioni frontali e di 20 ore (2CFU) di laboratorio Le prime si svolgeranno in aula con l’ausilio di Computer e videoproiettore per presentazione in PowerPoint. Le seconde si svolgeranno in laboratorio dove gli studenti familiarizzeranno con le comuni attrezzature e tecniche di laboratorio. Saranno richiamate le basi teoriche delle tecniche adottate, al fine di verificarne l’applicazione. Si tratterà di: soluzioni tampone per sistemi biologici e misurazione del pH; tecniche cromatografiche per la separazione di proteine; spettrofotometria; centrifugazione; elettroforesi di proteine; saggi di attività enzimatica; principi di quantificazione dei parametri cinetici di enzimi.

Prerequisiti

Fisica., Chimica e Biochimica Conoscenze inerenti alla struttura base delle proteine e degli enzimi. Tali conoscenze sono fornite attraverso l'insegnamento Biochimica

Verifiche dell'apprendimento

La prova finale consiste in un esame orale complessivo volto ad accertare le conoscenze della materia

Programma del Corso

Soluzioni: Richiami sulla teoria delle soluzioni. pH e tamponi Effetti del pH sulle attività biologiche Sistemi tampone dei fluidi cellulari. Tecniche elettrochimiche applicate alla chimica analitica classica e alla chimica clinica Misura del pH, della pCO2 e della concentrazione di HCO-3. Ionizzazione di aminoacidi e proteine in funzione del pH. Scelta di un tampone per la sperimentazione biologica. Sperimentazione Isolamento e purificazione di componenti subcellulari. Scelta del sistema biologico. Isolamento dell'organo. Frazionamento cellulare (metodi di rottura di cellule e tessuti). Sperimentazione Centrifugazione eseparazione per centrifugazione. Principi base della sedimentazione. Centrifughe e loro uso. Rotori. Metodi di separazione nella centrifuga preparativa. Centrifugazione differenziale. Centrifugazione in gradiente di densità. Elutriazione centrifugativa. Scelta, efficacia ed applicazione dei vari rotori. Problemi di sicurezza connessi all'uso delle centrifughe.Sperimentazione Isolamento e purificazione di proteine Precipitazione frazionata con sali, con solventi organici, al punto isoelettrico, al calore (denaturazione termica) Dialisi.Sperimentazione Tecniche di spettroscopia e loro applicazioni: La spettroscopia nell'ultravioletto e nel visibile. La spettrofluorimetria. Il dicroismo circolare. La spettroscopia NMR. Metodi cromatografici(o cromatografia) cromatografia per assorbimento, di ripartizione, a scambio ionico, per esclusione molecolare,per affinità. Efficienza dei procedimenti cromatografici e scelta di un procedimento conveniente. Sperimentazione Tecniche elettroforetiche Classificazione dei metodi elettroforetici. Elettroforesi in fase libera. Apparecchiatura di Tiselius. Elettroforesi zonale. Apparecchiatura per elettroforesi zonale Elettroforesi su gel. Elettroforesi su gel in condizioni denaturanti (SDS-PAGE). Western blotting Isoelettrofocalizzazione: principi , apparecchiatura e metodi. Sperimentazione Metodi per la determinazione delle proteine Metodo Lowry, Bradford, Biureto, Kyeldahl. Studi sulla struttura delle proteine. Determinazione della composizione aminoacidica: Idrolisi acida, alcalina, enzimatica. Analizzatore automatico di aminoacidi determinazione del peso molecolare. Determinazione della sequenza aminoacidica. Alcuni esempi d'impostazione metodologica nella ricerca biochimica. Sperimentazione Controllo dei metodi. Precisione, Accuratezza, stabilità dei reagenti, rapidità operativa,comparazione dei metodi e classificazione dei metodi analitici in base all'accuratezza.